Northern Blot

Définition

Le Northern Blot est l'une des principales techniques d'analyse moléculaire, qui consiste à mesurer le niveau d'expression d'un gène dans un ARNm spécifique et à le quantifier. Le Northern Blot est une technique moléculaire de transfert d'ARN. Cette technique a été dérivée du Southern Blot, qui diffère par l'utilisation de l'ADN au lieu de l'ARN pour l'analyse.

Le Northern Blot est une technique de détection de séquence spécifique d'ARN messager (ARNm) d'un oligonucléotide après leur séparation par électrophorèse, par hybridation avec une sonde d'ADN marqué. Une variante de la procédure connue sous le nom de Northern Blot inversé était occasionnellement utilisée.

Schéma d'un Northern Blot :

Schéma de trans d'ARN avec un Northern Blot.

Explications

Il y a deux raisons principales pour mesurer un ARNm avec un Northern Blot :

1. pour déterminer quels tissus expriment un gène particulier, expliquant l'indication possible de la fonction physiologique de la protéine codée, comme le gène Ob (obèse), qui, en décrivant son expression, il peut être noté que son produit protéique (leptine) régule la taille des amas graisseux;
2. pour connaître quels facteurs régulent l'expression d'un gène - qu'ils soient nutritionnels, hormonaux ou environnementaux -.

Les transferts Northern sont utilisés pour déterminer l'identité, la taille et l'abondance de séquences d'ARN spécifiques. Les protocoles de transfert Northern commencent par l'isolement de l'ARN et les techniques de séparation varient en fonction de la taille de l'ARN. Les gros ARN sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose au formaldéhyde ou sur un gel d'agarose au glyoxal, ce qui empêche l'appariement normal des bases et maintient l'ARN dans un état dénaturé.

Les petits ARN sont séparés sur un gel de polyacrylamide dénaturant (urée). L'ARN est ensuite transféré du gel sur une membrane en nylon qui est ensuite incubée avec une sonde d'ARN, d'ADN ou d'oligodésoxynucléotide marquée radioactivement ou non isotopiquement. La sonde non hybridée est éliminée par lavage avec un tampon. Les sondes radiomarquées sont visualisées avec un film radiographique et les sondes marquées par voie enzymatique sont visualisées par chimiluminescence.

Northern Blot inversé

Dans la procédure de Northern Blot inversé, l'acide nucléique (qui était attaché à la membrane) est une collection de fragments d'ADN isolés, et la sonde était de l'ARN extrait du tissu et radiomarqué.

Protocole

Le principe de base du Northern Blot est la séparation de l'ARN par sa taille et il est détecté sur une membrane de nylon par une sonde d'hybridation qui aura la séquence de base complémentaire de l'ARNm. Il est à noter que, bien que le terme Northern Blotting soit strictement appliqué au transfert d'un ARN par électrophorèse sur gel sur une membrane, la procédure totale est superficiellement désignée par cette méthode.

Pour exécuter la technique, il est nécessaire de suivre correctement les huit étapes du processus.

Dans la première étape, il y a l'extraction de l'ARN total d'un tissu à partir de l'ADN collecté (échantillon d'étude), donc, pour avoir une molécule simple brin, il est nécessaire d'utiliser des agents chaotropiques - des molécules capables de casser le des liaisons hydrogène entre les bases azotées dans les macromolécules - telles que l'isothiocyanate de guanidinium. Ces agents dénaturent les protéines (et les ARNases), perturbent les cellules et rendent l'ARN soluble.

Comme dans toute technique biochimique, le soin est de mise dans son exécution, dans Northern Blot il y a sa particularité. Le problème particulier de cette méthode est le potentiel de dégradation de l'ARN par les ARNases. Ces enzymes sont largement distribuées dans les tissus et leur contamination environnementale intervient facilement dans les étapes d'analyse, principalement par les doigts. Pour éviter cette contamination, les matériaux métalliques, la verrerie et les solutions à utiliser dans les étapes doivent être stérilisés par une cuisson appropriée, et de nouveaux gants en latex sans talc et inhibiteurs de RNase doivent être utilisés, évitant ainsi la perte ou la réduction de l'ARN collecté.

Dans la deuxième étape, il y a l'isolement de l'ARNm de l'ARN total, donnant une plus grande sensibilité. Cet isolement est nécessaire car seuls quelques ARN du total sont des ARNm (les ARNm qui contiennent la séquence du gène cible qui sera exprimée, et de cette façon il sera plus facile à visualiser). Cette séparation se fait par l'ajout de la queue poly-A impliquant une colonne d'oligonucléotides de thymine (oligo-T), qui permettra ultérieurement la liaison de la queue poly-A à l'ARNm; lorsqu'il est ajouté, la synthèse commence aux extrémités 3′ OH libres. Les oligos-T ont la fonction d'amorces, car ils vont compléter les séquences de queue poly-A et, par conséquent, ils vont pouvoir se lier à l'ARNm, permettant de le distinguer de l'ARN total.

Dans la troisième étape, les ARN extraits, ARNm totaux ou sélectionnés + poly-A, sont séparés selon leur taille moléculaire par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel est utilisé dans l'agarose pour les macromolécules. En raison des groupes phosphate, l'ADN lorsqu'il est dans un milieu neutre ou basique a une charge négative. Pour que l'ADN acquière cette charge, une solution alcaline est ajoutée au gel d'agarose, puis un champ électrique est induit avec deux pôles : un négatif et un positif, ainsi, la macromolécule va migrer vers le pôle positif (anode). La vitesse de migration et le pouvoir de résolution du gel dépendent de la taille et de la forme de la molécule – les plus grosses migrent lentement, tandis que les plus petites migrent rapidement -. De plus, l'utilisation d'agents dénaturants dans le gel est obligatoire, généralement du formaldéhyde est utilisé, car,celui-ci réagit de manière covalente avec les groupes amine de l'adénine, de la guanine et de la cytosine, et ainsi, l'appariement entre les bases ne survient pas.

Dans la quatrième étape, un buvardage (buvardage) sur la membrane de nylon a lieu. Les membranes en nylon sont préférées à la nitrocellulose car elles sont chargées positivement, augmentant leur capacité de liaison aux acides nucléiques et leur plus grande robustesse à la manipulation. Ce blot peut être sous vide (transfert plus rapide et plus reproductible) ou capillaire (sans l'utilisation d'un équipement spécial). Par la traînée que font les macromolécules lorsqu'elles sont attirées vers le pôle positif, ce flou est créé et ainsi, fournit une réflexion précise sur la membrane avec les ARN séparés dans le gel d'agarose. Cependant, comme le gel est trop fragile pour être sondé directement et que les sondes d'hybridation ne pénètrent pas directement dans les gels, il est nécessaire d'immobiliser l'ARN.

Dans la cinquième étape, l'ARN est immobilisé sur la membrane, soit par cuisson dans un four à température élevée (95 °C par minute) soit par exposition aux UV légers. Cette immobilisation entraînera la liaison covalente de l'ARN à la membrane, ce qui empêchera l'acide nucléique d'être emporté pendant le traitement.

Dans la sixième étape, la sonde d'hybridation doit être préparée. L'hybridation d'un acide nucléique nécessite que la sonde ait la complémentarité de sa séquence d'ARNm cible, l'appariement de bases survenant avec la sonde marquée par un radio-isotope ou un colorant fluorescent. Il existe deux formes principales d'hybridation : par ADN complémentaire (ADNc) ou par oligonucléotides antisens. L'hybridation par ADNc a ses avantages car elle est simple (nécessitant l'isolement de plasmides pour la quantification du gène spécifique) et a un temps réduit, pour ces raisons, c'est la méthode la plus utilisée en Northern Blot. Cependant, l'ADNc est plus susceptible d'être discriminé par les ARNases.

Dans la septième étape, la sonde s'hybride à la membrane de nylon, suivie d'une post-hybridation. Une fois l'hybridation sur la membrane terminée, plusieurs lavages stringents (réalisés avec une solution tampon astringente) ont lieu pour s'assurer que la sonde est spécifiquement liée à l'ARNm cible et qu'elle est liée de manière négligeable aux autres ARNm.

Dans la huitième étape, il y a la détection de l'hybridation, en observant si le gène cible a été identifié ou non. Les signaux sont ensuite détectés, le plus souvent par des films radiographiques (par radioactivité ou chimioluminescence) et quantifiés par densitométrie, qui est la mesure de la densité optique sur des plaques photographiques. Cette quantification est basée sur des unités arbitraires et des changements relatifs entre les groupes expérimentaux et témoins.

Il est à noter que la détection des sondes se fait avec ou sans radioactivité. Avec la radioactivité, une sonde marquée avec le radio-isotope 32P ou avec des colorants fluorescents est utilisée, qui, lors de la réception de films radiographiques, émet le rayonnement nécessaire à l'identification du gène marqué. Sans radioactivité, on utilise la chimioluminescence, qui est basée sur la dégradation de substances chimiques spécifiques, dont les substrats sont catalysés par la phosphatase alcaline par l'émission de lumière. Ces enzymes peuvent être conjuguées à une sonde ou marquées par un ligand - le plus utilisé est la digoxigénine - qui sera localisé par son anticorps, auquel est liée la phosphatase alcaline.

Technique similaire (puces à ADN)

L'utilisation des puces à ADN, qui a commencé à se répandre à la fin des années 1990 et au début des années 2000, utilise une technique plus proche de la procédure inverse, qui implique l'utilisation de fragments d'ADN isolés fixés à un substrat, et l'hybridation avec une sonde constituée d'ARN cellulaire. Ainsi, la procédure de Northern Blot inversé, bien qu'à l'origine peu courante, a permis d'étudier l'expression génique de plusieurs gènes simultanément, en utilisant une analyse Northern.

Différences entre un Southern, Northern et Western Blot

Différentes techniques de transfert sont utilisées pour identifier des protéines uniques et des séquences d'acides nucléiques. Les protocoles de transfert Southern Blot, Northern Blot et Western Blot sont similaires et commencent par la séparation électrophorétique des fragments de protéines et d'acides nucléiques sur un gel, qui sont ensuite transférés sur une membrane (membrane de nitrocellulose, membrane de difluorure de polyvinylidène -PVDF-, etc.) où ils sont immobilisés. Cela permet aux anticorps radiomarqués ou marqués par voie enzymatique ou aux sondes d'ADN de se lier à la cible immobilisée. Ensuite, les molécules d'intérêt peuvent être visualisées avec diverses méthodes. Les techniques de transfert sont sélectionnées en fonction de la molécule cible : ADN, ARN ou protéine.

Northern Blot pour les études nutritionnelles

Pour accroître l'accessibilité du Northern Blot à des fins nutritionnelles et physiologiques, l'utilisation du protocole non radioactif se développe. De plus, il y a une réflexion dans la science actuelle sur les inconvénients des radio-isotopes, tels que la sécurité à risque pour l'environnement et la santé du chercheur, l'instabilité des sondes en raison de leur courte demi-vie, et les difficultés à éliminer les déchets sans pollution. Pour ces raisons mentionnées, il y a une utilisation croissante de la chimiluminescence dans le Northern Blot.

Il convient de noter que cette technique d'analyse moléculaire est largement utilisée pour identifier des gènes spécifiques dans les sciences de la nutrition, dans le but d'identifier les facteurs d'expression génique de certaines maladies et également la spécificité tissulaire d'un tel gène exprimé, comme mentionné précédemment, le gène Ob de l'obésité.

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