Southern Blot
Définition
Le Southern Blot peut être utilisé pour détecter l'identité, la taille et l'abondance de l'ADN. Si un scientifique veut savoir si un organisme a une mutation génétique particulière, le Southern blot peut être utilisé pour identifier la présence de ce gène muté. La technique a été Inventée par Edwin Mellor Southern.
Exemple de Southern Blot :
Procédure de transfert par Southern Blot. Le transfert de points ne nécessite pas d'électrophorèse sur gel ni de transfert, mais la solution d'ADN est déposée directement sur la membrane. L'ADN est dénaturé par la chaleur ou un alcali, pour séparer les deux brins, puis appliqué sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose selon un schéma régulier par pipette ou par aspiration à travers un dispositif spécial. La membrane est ensuite incubée dans une solution contenant de l'ADN sonde marqué, qui se lie uniquement à l'ADN de l'espèce cible. Le marqueur peut être radioactif, fluorescent ou enzymatique. Après développement du radiogramme (pour les sondes radioactives), la tache d'ADN de l'espèce cible produira une tache sombre sur le film.
Explications
Dans le Southern Blot, l'ADN est fragmenté en morceaux plus petits, exécutés sur un gel, et transféré sur une membrane pour analyse par hybridation d'une sonde marquée par radioactivité ou fluorescence. Si l'ADN est complémentaire de la sonde (par exemple, a la séquence du gène muté que le chercheur recherche), alors la sonde se liera à l'échantillon, le marquant ainsi. Le marqueur peut ensuite être visualisé par autoradiographie et film radiographique pour les sondes marquées radioactivement ou par la présence de fluorescence pour les sondes marquées par fluorescence. Des méthodes de détection basées sur la colorimétrie et la luminescence sont également couramment utilisées. Dans tous les cas, le résultat peut être quantifié par la force du signal par rapport à un échantillon témoin.
Les applications de Southern Blot vont de la confirmation des résultats d'expériences de clonage ou d'inactivation à la médecine légale et au diagnostic clinique. Un exemple de Southern blot utilisé pour identifier une mutation génétique est le test génétique utilisé pour la drépanocytose. Le transfert de Southern, en conjonction avec l'analyse par digestion de restriction, est utilisé pour identifier la présence du gène muté de la β globine qui provoque l'anémie falciforme. La mutation arrive à détruire une séquence reconnue par l'enzyme de restriction MstII. Lorsqu'une digestion de restriction avec MstII et un transfert de Southern sont effectués sur un échantillon provenant d'un individu sans anémie falciforme, deux fragments d'ADN sont observés car l'ADN a le site où MstII coupe. Chez un patient atteint d'anémie falciforme, l'enzyme ne coupe pas l'ADN, de sorte qu'un seul fragment d'ADN est observé.
Aujourd'hui, le Southern Blot a été largement remplacé par la PCR en temps réel pour répondre aux mêmes questions expérimentales. La PCR en temps réel détecte et quantifie un gène ou une séquence d'ADN d'intérêt en enregistrant l'abondance de l'ADN tout au long du processus d'amplification, plutôt qu'à la fin comme dans la PCR standard. Cela permet au chercheur de comparer différentes séquences d'ADN pour voir laquelle est la plus abondante dans un échantillon. Alors que le Southern blot demande beaucoup de travail et nécessite une grande quantité d'ADN de haute qualité, la PCR en temps réel présente plusieurs avantages, notamment une automatisation plus facile, un dépistage à plus haut débit et une exigence moindre pour la quantité d'ADN utilisée, ce qui permet au chercheur d'économiser du temps et des ressources. Pourtant, les chercheurs générant des animaux transgéniques peuvent choisir le transfert de Southern pour dépister les animaux transgéniques fondateurs pour le transgène inséré, car les transferts de Southern ont un taux de faux positifs inférieur à celui de la PCR en temps réel.
La membrane est exposée à une sonde d'ADN marquée avec une étiquette radioactive ou chimique.
Les gels de Southern Blot, de cartographie de restriction et de séquençage sont des techniques classiques qui ont permis de nombreuses découvertes scientifiques fondamentales. Bien que de nouvelles techniques les aient largement remplacées, ces techniques ont toujours des applications utiles et ont éclairé de nombreuses techniques actuelles. Par exemple, la cartographie de restriction a conduit à des technologies d'ADN recombinant qui sont désormais monnaie courante dans les laboratoires.
Étonnamment, les Southern blots sont encore utilisés. Dans les années 1980, environ 300 articles par an citaient l'utilisation de Southern blots. Ce nombre a culminé en 1992 et 1993 à environ 3 000 citations par an. Maintenant, alors que la PCR, les puces à ADN et le NGS dominent la scène de l'analyse de l'ADN, à peu près le même nombre de Southerns sont cités que dans les années 1980.
Synonymes, antonymes
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