Western Blot

Définition

Le Western Blot est une technique visant à détecter ou quantifier une ou des protéines au sein d'un échantillon, à l'aide d'anticorps. Une réaction antigène anticorps est provoquée avec un virus sur bande de nitrocellulose après électrophorèse. Il est parfois appelé immunoblot ou technique des immuno-empreintes.

Le Western Blot est une technique très utile pour la détection des protéines car elle permet également à l'utilisateur de quantifier l'expression des protéines. Le transfert Western peut être considéré comme un équilibre complexe, car le chercheur tente d'obtenir un signal non spécifique mais fort.

Le processus d'un Western Blot :

Illustration graphique du Western Blot. Le Western Blot commence par le transfert des protéines résolues dans le gel de polyacrylamide sur une membrane de PVDF ou de nitrocellulose. Le blot est ensuite bloqué avec du lait écrémé, de la BSA ou de la gélatine, suivi d'une incubation avec des dilutions d'anticorps primaires et secondaires. Des étapes de lavage appropriées entre les incubations sont importantes pour une analyse Western Blot réussie.

Explications

Les protéines sont d'abord séparées par électrophorèse sur gel puis transférées sur une membrane de nitrocellulose. Ensuite, elles sont mises en contact avec des anticorps spécifiques d'une protéine pour la repérer.

Des bandes foncées apparaissent après traitement par un réactif donnant un profil de virus pour l'échantillon de sérum sanguin testé.

Le Western blot est souvent utilisé dans la recherche pour séparer et identifier les protéines. Dans cette technique, un mélange de protéines est séparé en fonction du poids moléculaire, et donc par type, par électrophorèse sur gel. Ces résultats sont ensuite transférés sur une membrane produisant une bande pour chaque protéine. La membrane est ensuite incubée avec des anticorps marqueurs spécifiques de la protéine d'intérêt.

L'anticorps non lié est lavé, ne laissant que l'anticorps lié à la protéine d'intérêt. Les anticorps liés sont ensuite détectés en développant le film. Comme les anticorps ne se lient qu'à la protéine d'intérêt, une seule bande doit être visible. L'épaisseur de la bande correspond à la quantité de protéine présente; ainsi faire une norme peut indiquer la quantité de protéines présentes.

Technique de lyse cellulaire pour extraire les protéines

Les protéines peuvent être extraites de différents types d'échantillons, tels que des tissus ou des cellules. Voici le protocole pour extraire les protéines des cellules adhérentes.

Pour les cellules adhérentes, il est indispensable de laver les cellules dans le flacon ou le plat de culture tissulaire en ajoutant une solution saline tamponnée au phosphate froide et en secouant doucement.

Les lysats cellulaires sont la forme d'échantillon la plus courante utilisée pour le Western blot. L'extraction des protéines tente de collecter toutes les protéines dans le cytosol cellulaire. Cela devrait être fait à une température froide avec des inhibiteurs de protéase pour éviter la dénaturation des protéines. Étant donné que l'échantillon de tissu présente un degré de structure plus élevé, une invention mécanique, telle que l'homogénéisation ou la sonication, est nécessaire pour extraire les protéines.

Après avoir extrait la protéine, il est très important d'avoir une bonne idée de la concentration de l'extrait. Cela permet éventuellement au chercheur de s'assurer que les échantillons sont comparés sur une base équivalente. La concentration en protéines est souvent mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. L'utilisation de cette concentration permet de mesurer la masse de la protéine qui est chargée dans chaque puits par la relation entre la concentration, la masse et le volume.

Après avoir déterminé le volume approprié de l'échantillon, celui-ci est dilué dans un tampon de charge contenant du glycérol afin que les échantillons s'enfoncent facilement dans les puits du gel. Un colorant de suivi (bleu de bromophénol) est également présent dans le tampon permettant au chercheur de voir jusqu'où la séparation a progressé. L'échantillon est chauffé après avoir été dilué dans un tampon de charge, afin de dénaturer la structure d'ordre supérieur, tout en conservant les ponts sulfures. La dénaturation de la structure haute garantit que la charge négative des acides aminés n'est pas neutralisée, permettant à la protéine de se déplacer dans un champ électrique (appliqué lors de l'électrotransfert).

Il est également très important d'avoir des contrôles positifs et négatifs pour l'échantillon. Pour un contrôle positif, une source connue de protéine cible, telle qu'une protéine purifiée ou un lysat de contrôle, est utilisée. Cela permet de confirmer l'identité de la protéine et l'activité de l'anticorps. Un contrôle négatif est une lignée cellulaire nulle, telle que la β-actine, est également utilisée pour confirmer que la coloration n'est pas non spécifique.

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