Enzyme de restriction

Définition

Une enzyme de restriction est une enzyme qui coupe l'ADN bicaténaire en des sites spécifiques, situés entre les nucléotides. Cette endonucléase de restriction est une enzyme capable de reconnaître une séquence caractéristique de nucléotides dans une molécule d'ADN et de couper l'ADN à ce point particulier, appelé site ou cible de restriction, ou sur un site pas trop éloigné. Les sites de restriction ont entre quatre et six paires de bases avec lesquelles ils sont reconnus.

Des enzymes de restriction (endonucléases) :

Les enzymes de restriction avec Escherichia coli (Eco).

Explications

Le mécanisme de la coupe de l'ADN est réalisé par la rupture de deux liaisons phosphodiester dans le double brin, ce qui se traduit par deux extrémités de l'ADN. Celles-ci peuvent être franches (lorsque les liens rompus coïncident) ou cohérentes / décalées. Ces derniers ont tendance à se rejoindre spontanément, car les extrémités peuvent être reliées à d'autres extrêmes coïncidents qui peuvent se trouver à proximité (appariement Watson et Crick).

Les fragments d'ADN ainsi obtenus peuvent être liés par d'autres enzymes appelées ligases.

Les enzymes de restriction qui, bien que différentes et provenant d'espèces différentes, ont la même séquence de reconnaissance et laissent la même extrémité cohésive, mais ne coupent pas au même endroit, sont appelées isoschizomères. Par exemple, il y a les isoschizomères Asp7 et Kpn I.

Le prix Nobel de médecine 1978 a été décerné aux microbiologistes Werner Arber, Daniel Nathans et Hamilton Smith pour la découverte des endonucléases de restriction qui ont mené au développement de la technologie de l'ADN recombinant. La première utilisation pratique de leur travail a été la manipulation de bactéries E. coli pour produire de l'insuline humaine pour les diabétiques.

Un des domaines dans lesquels les enzymes de restriction ont été le plus impliqués a été le diagnostic de maladies génétiques liées à des modifications de la séquence d'ADN, qu'il s'agisse de mutations ponctuelles, d'insertions ou de délétions de fragments. S'ils sont produits dans un site de reconnaissance d'enzymes de restriction, ils élimineront ou ajouteront de nouveaux sites de coupe lorsqu'ils existent. Lors de l'application de cette enzyme au gène d'une personne en bonne santé et d'une personne malade, des quantités différentes de fragments doivent être observées pour chaque cas dans une électrophorèse.

Systèmes de restriction-modification (MR)

Le système de restriction-modification (MR ou RM) est utilisé in vivo par les bactéries pour protéger contre les attaques d'ADN exogènes (normalement virales) qui entrent dans la bactérie, éliminant les séquences étrangères au génome. Le propre ADN ne subit pas de délétion par les enzymes de restriction de l'organisme qui les produit, car auparavant il a été modifié par méthylation par l'action d'une méthyltransférase, une enzyme qui transfère les groupes méthyle de la S-adénosyl-méthionine (SAM). à des bases spécifiques. Ce système a été découvert en 1968 à la suite d'une série d'études sur l'infection par le phage 1 chez deux souches différentes d'Escherichia coli (appelées souches "K12" et "B").

Ce système est composé de deux parties :

• Restriction : permet aux bactéries de se protéger contre l'ADN exogène pour éviter la "promiscuité" dans les échanges génétiques. Cela confère une immunité contre les bactériophages qui pourraient mettre en péril l'individualité génétique ou même la vie de la bactérie, grâce à des coupures par des endonucléases de restriction à de l'ADN exogène qui pénètre dans la bactérie.
• Modification : consiste en l'introduction de groupes méthyle (CH₃^-) dans certaines bases au sein de certaines séquences d'ADN, catalysée par une méthylase spécifique.

Il existe plusieurs mécanismes d'action généraux de ces systèmes, dont les types I et II se distinguent :

• MR type I : Ils ont été les premiers à être décrits. La caractéristique des systèmes IRM de type I est que les activités de modification et de restriction sont produites par un complexe multiprotéique qui effectue les deux types d'activités. Certaines fonctionnalités sont les suivantes :
  • Ils reconnaissent des séquences relativement grandes qui n'ont pas de symétrie.
  • L'activité de restriction (des sous-unités R) se sépare du site de reconnaissance (de l'ordre d'environ 1 000 pb) et dans des endroits non spécifiques.
  • La restriction nécessite l'ATP.
  • L'activité méthylase du complexe utilise la S-adénosyl-méthionine (SAM) comme donneur des groupes méthyle.
• MR type II : Ici, chaque sous-unité du dimère reconnaît la même séquence, présente dans chacune des parties spéculaires du palindrome, et effectue une coupe à un endroit spécifique, qui correspond évidemment à l'autre chaîne de l'autre moitié du palindrome. Plus d'un tiers des souches bactériennes ont au moins un système de type MR II. Beaucoup d'entre eux sont codés à partir de gènes situés dans des plasmides. Certaines fonctionnalités de ce mécanisme sont :
  • Les deux activités sont réalisées par deux protéines différentes qui ne forment pas de complexes multiprotéiques.
  • Ils n'utilisent pas d'ATP. Ils n'ont besoin que des ions Mg ++ pour fonctionner. La méthylase utilise SAM comme donneur de méthyle.
  • Chaque membre de la paire de modification et de restriction reconnaît la même séquence d'ADN spécifique.
  • Le site de reconnaissance se compose de 4 ou 6 pb constituant une séquence palindromique.
  • La méthylase est généralement une protéine monomère, qui introduit des groupes méthyle dans un A ou dans un G (selon la méthylase en question), dans les deux chaînes, au sein du site de reconnaissance.
  • L'enzyme de restriction est généralement une protéine formée de deux sous-unités du même type, assemblées symétriquement. Ils peuvent laisser des extrémités cohésives ou des extrémités émoussées. Certaines enzymes de restriction laissent des extrémités saillantes 5ℙ, tandis que d'autres laissent des extrémités saillantes 3′.

Types

Il existe en général 3 systèmes d'enzymes de restriction :

• Type 1 : Une seule enzyme (avec 3 sous-unités) a une activité de restriction (courte) et une modification (méthylation). En reconnaissant la séquence d'ADN spécifique coupée au hasard sur des sites autres que le site de reconnaissance, en amont ou en aval. La coupe laisse des extrémités cohésives. Ils ont besoin de l'ATP pour se déplacer dans l'ADN, du site de reconnaissance au site de coupe (environ 1 000 paires de bases), en plus du SAM (S-adénosyl-méthionine) et du Mg²⁺ comme cofacteurs.
• Type 2 : Ils ont seulement une activité de restriction. D'autres enzymes effectuent la méthylation. La coupe est faite dans le site de reconnaissance ou à proximité, de sorte que la coupe est résistante et prévisible. En raison de cette caractéristique, ils sont largement utilisés pour le clonage de gènes, car lors de la découpe sur des sites spécifiques, des séquences connues peuvent être récupérées. Ils n'ont besoin que de Mg²⁺ comme cofacteur, ils n'ont pas besoin d'ATP.
• Type 3 : Une enzyme oligomère est utilisée qui effectue toutes les activités enzymatiques. Ils ont une fonction de restriction et de modification. Ils ont coupé de 25 à 27 paires de bases loin du site de reconnaissance, laissant des extrémités cohésives. Ils nécessitent deux séquences de reconnaissance en orientation opposée dans la même chaîne d'ADN. Ils ont besoin d'ATP, de Mg²⁺ et de SAM (S-adénosyl-méthionine) en tant que cofacteurs.

Il existe d'autres systèmes de restriction actuellement découverts, tels que le système de type 4 d'E. coli (Eco 571) qui consiste en une seule enzyme qui ne coupe que l'ADN méthylé dans une séquence spécifique, et qui méthyle également.

Applications dans le diagnostic des maladies génétiques

✅ Voir le polymorphisme, avec la RFLP ou le polymorphisme de taille des fragments de restriction.

Grâce aux enzymes de restriction, nous sommes en mesure de diagnostiquer certaines maladies génétiques, dues soit à une variation du matériel génétique (duplication, délétion, etc.), soit à une mutation ponctuelle. La procédure pour ce diagnostic serait d'amplifier par PCR une région spécifique du chromosome où l'on sait que ce changement génétique devrait être ou non et d'ajouter l'enzyme ou les enzymes de restriction pour que les coupes pertinentes soient effectuées.

Les sites des enzymes de restriction :

L'ADN d'organismes apparentés présente de petites différences de séquence qui provoquent des changements dans les sites de restriction. Dans l'exemple présenté, couper un segment d'ADN du premier organisme donne six fragments de tailles différentes (marqués a–f sur le gel). Si la région équivalente d'ADN d'un organisme apparenté était digérée avec la même enzyme, on s'attendrait à un schéma similaire. Ici, une différence d'un seul nucléotide est présente, ce qui élimine l'un des sites de restriction. Par conséquent, la digestion de cet ADN ne produit que cinq fragments. Les fragments c et d ne sont plus visibles mais forment une nouvelle bande étiquetée cd.

Après avoir effectué ces coupes, nous exécutons nos échantillons dans un gel d'électrophorèse et constatons les différences de tailles existantes. Si la mutation génère une délétion, lors de l'exécution de l'électrophorèse, nous observerons un fragment plus petit que ce à quoi on pourrait s'attendre d'un patient sain, de manière à pouvoir le diagnostiquer. Si, au contraire, la mutation génère une mutation ponctuelle, nous pouvons en tirer parti pour utiliser une enzyme à ce stade et que, s'il n'y a pas de mutation, cette coupe n'interviendra pas et un fragment plus important sera obtenu dans le gel d'électrophorèse.

Les enzymes de restriction sont utiles pour de nombreuses applications différentes. Étant donné que la séquence d'ADN est différente dans chaque organisme, le schéma des sites de restriction sera également différent. La source d'ADN isolé peut être identifiée par ce motif. Si l'ADN génomique est isolé d'un organisme et coupé avec une enzyme de restriction particulière, un ensemble spécifique de fragments peut être séparé et identifié par électrophorèse. Si l'ADN d'un organisme différent est coupé par la même enzyme de restriction, un ensemble différent de fragments sera généré. Cette technique peut être appliquée à l'ADN de deux individus de la même espèce. Bien que les différences de séquence d'ADN soient faibles, des enzymes de restriction peuvent être utilisées pour identifier ces différences. Si la différence de séquence tombe dans un site de reconnaissance d'enzyme de restriction, cela donne un polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP). Lorsque les modèles d'enzymes de restriction sont comparés, le nombre et la taille d'un ou deux fragments seront affectés pour chaque différence de base qui affecte un site de coupure.

En rapport avec "enzyme de restriction"

• enzyme

  

  Une enzyme est un catalyseur biologique, presque toujours une protéine. Elle accélère le déroulement d'une réaction chimique spécifique dans la cellule.

• enzyme allostérique

  

  Une enzyme allostérique participe à une allostérie, c'est-à-dire avec deux sites de liaison à deux ligands différents.

• enzyme de conversion

  

  Une enzyme de conversion qualifie une exopeptidase produite par le foie.

• apoenzyme

  

  Une apoenzyme est une partie protéique d'une enzyme, qui doit être activée par une coenzyme ou un cofacteur.