Vecteur de clonage

Définition

Un vecteur de clonage est un plasmide recombiné (phagémide) qui, grâce à sa réplication autonome, permet de cloner des gènes. Ces vecteurs moléculaires de clonage sont des molécules transportant des fragments d'ADN répliqués portant des fragments insérés en utilisant des techniques d'ADN recombinant.

Afin de servir de vecteur ("véhicule"), une molécule doit pouvoir se répliquer avec le fragment d'ADN qu'elle porte. Il doit également avoir des séquences de reconnaissance qui permettent l'insertion du fragment d'ADN à cloner. Leur utilisation est exclusive aux techniques de génie génétique. Le vecteur de clonage est aussi appelée un vecteur navette.

Représentation d'une molécule vectrice :

Schéma d'un vecteur de clonage, comprenant les éléments de séquence essentiels dans son squelette (représentation schématique d'une molécule vectrice, y compris ses caractéristiques essentielles).

Explications

Pour insérer un fragment d'ADN dans un vecteur, on utilise une enzyme de restriction qui est mélangée avec des fragments d'ADN produits avec la même enzyme. Par la suite, l'enzyme phosphatase alcaline est ajoutée, qui est chargée d'empêcher la recircularisation du vecteur, car il ajoute une extrémité phosphate 3′ qui évite l'union des deux extrémités ainsi que la complémentarité et la formation d'une liaison phosphodiester. Immédiatement, l'ADN qui a l'intention d'être inséré dans le vecteur est ajouté, où l'une des extrémités est jointe par complémentarité et une ligase est utilisée pour générer l'union et sa recircularisation.

Les vecteurs qui portent un fragment inséré sont appelés vecteurs recombinants.

Chaque vecteur de clonage doit contenir les éléments suivants :

• Origine de réplication : C'est la région qui code pour le début de la synthèse d'ADN, ce qui lui donne la qualité de pouvoir se répliquer indépendamment de l'ADN chromosomique, soit dans un système bactérien soit dans un système d'expression de levure.
• Agent de sélection : Ce sont des gènes contenus dans la séquence vectorielle, qui confèrent des caractéristiques supplémentaires au système de clonage (bactéries, levures, etc.), qui permettent l'identification et la sélection de clones recombinants, c'est-à-dire des clones qui contiennent le Fragment d'ADN d'intérêt. Des exemples de cela sont les gènes qui codent pour la résistance aux antibiotiques, tels que ceux pour la résistance à l'ampicilline ou à la tétracycline, ou inversement, ils peuvent être des marqueurs métaboliques tels que le gène lac Z, qui code pour la synthèse de l'enzyme bêta galactosidase ou marqueurs auxotrophes, tels que le gène qui code pour la synthèse d'histidine (largement utilisé dans les systèmes d'expression et de clonage chez la levure).
• Site de multiclonage (polylinker) : région contenue dans les séquences des gènes qui codent pour les marqueurs, qui contiennent plusieurs sites de restriction, c'est-à-dire plusieurs sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction, qui permettent l'insertion de fragments d'ADN à cloner dans un système.

Types de vecteurs

Les principaux vecteurs de clonage sont les plasmides car ils ont été les premiers vecteurs développés et sont encore largement utilisés. Ces vecteurs proviennent de molécules d'ADN double brin extrachromosomiques naturelles qui se répliquent de manière autonome dans les cellules bactériennes.

Par exemple, pUC18 est un plasmide largement utilisé, car il présente des caractéristiques très bénéfiques :

• Il est dérivé de pBR322.
• Il est petit, il peut donc porter des fragments d'ADN relativement gros (environ 10 000 paires de bases).
• Il a une origine de réplication et peut produire jusqu'à 500 copies des fragments d'ADN insérés par cellule.
• Il a été modifié pour présenter de nombreuses séquences de reconnaissance des enzymes de restriction qui ont été regroupées dans une région appelée "polylinker" ou site de clonage multiple.
• Il permet d'identifier facilement les plasmides recombinants, car il contient un fragment du gène bactérien lacZ qui produit des colonies bleues, en dépliant et en précipitant le réactif X-Gal, au moyen de l'enzyme bêta-galactosidase codée par lacZ. Si un fragment d'ADN est inséré dans le polylinker, ce gène est inactivé, l'enzyme bêta galactosidase n'est pas produite et donc le X-gal ne précipite pas et il en résulte des colonies blanches.

D'autres vecteurs de clonages sont disponibles :

• bactériophage lambda (phage λ) : Le génome du phage lambda a été entièrement cartographié et séquencé. Pour être utilisé comme vecteur, le tiers central de son chromosome peut être remplacé par de l'ADN exogène, sans affecter la capacité du phage à infecter les cellules et à former des capsides. Pour cloner l'ADN en utilisant ce vecteur, l'ADN phagique est purifié et coupé avec une enzyme de restriction, avec la même enzyme de restriction, nous coupons le fragment d'ADN d'intérêt et les joignons avec une ADN ligase. Les vecteurs lambda recombinants sont conditionnés in vitro dans les capsides protéiques phagiques et sont introduits dans les cellules hôtes bactériennes. Au sein des bactéries, les vecteurs se répliquent et forment de nombreuses copies du phage infectieux, qui portent tous le fragment d'ADN d'intérêt pour le clonage. Les vecteurs phages peuvent transporter des fragments jusqu'à 20 kb (kilobases).
• Cosmides : Les cosmides sont des vecteurs hybrides utilisant des parties du chromosome lambda et des plasmides. Ils ont la séquence cos du phage lambda, nécessaire pour le conditionnement de l'ADN du phage dans sa couche protéique, ils contiennent également des séquences plasmidiques nécessaires à la réplication et aux gènes de résistance aux antibiotiques. Les cosmides peuvent transporter près de 50 kb d'ADN inséré.
• YAK (chromosome artificiel de levure) : Les YAC sont des chromosomes de levure artificielle. Un YAC a des télomères à ses extrémités, une origine de réplication et un centromère. Ces composants sont liés à des gènes marqueurs de sélection et à un groupe d'enzymes de restriction pour insérer de l'ADN exogène. Ces chromosomes de levure artificielle permettent le clonage de gros morceaux d'ADN, 100–1 000 kb.
• BAC (chromosome artificiel bactérien) : Un BAC est un chromosome artificiel bactérien, basé sur le plasmide de fertilité (facteur F) des bactéries. C'est le plus utilisé. Le facteur F est un plasmide à réplication indépendante qui transfère des informations génétiques lors de la conjugaison bactérienne. Les BAC sont circulaires et très stables, donc ils ne se cassent pas. Ils ont une taille de 100 ko et peuvent transporter des inserts entre 100 et 300 ko. Ils ne permettent qu'une seule copie du chromosome par cellule.

Vecteur plasmidique

Le vecteur plasmidique de clonage est généralement utilisé pour cloner des fragments d'ADN jusqu'à 15 kpb. Les plasmides sont extra-chromosomiques, ce qui facilite l'introduction d'ADN étranger dans une cellule plutôt que l'intégration d'ADN dans le chromosome. Les plasmides s'auto-répliquent, entraînés par une origine de réplication. Les plasmides sont de petite taille, ce qui facilite leur travail et leur transformation en leur hôte.

À l'aide d'un vecteur plasmidique codant pour le gène du facteur de croissance des hépatocytes humains (HGF), un puissant facteur angiogénique, ils ont démontré que l'UMGD de l'ADN plasmidique du HGF dans les 2 heures suivant la ligature de l'artère coronaire entraînait une augmentation de la densité artérielle et capillaire dans la zone à risque, une cicatrice plus petite taille, réduction de la fibrose interstitielle et prévention du remodelage indésirable du VG, après un infarctus du myocarde.

Des vecteurs plasmidiques utilisant la résistance à la puromycine comme marqueur sélectif ont été développés pour de nombreuses archées méthanogènes. Les vecteurs actuels sont construits soit avec une réplication autonome à partir d'origines en cercle roulant, soit avec la capacité de s'intégrer dans le chromosome en utilisant des marqueurs de cassette flanqués de fragments d'ADN chromosomiques pour favoriser la réplication homologue.

En rapport avec "vecteur de clonage"

• ADN

  

  L'ADN (l'acide désoxyribonucléique) est la molécule qui transporte l'information génétique nécessaire au développement et au fonctionnement d'un organisme.

• ADN recombinant

  

  L'ADN recombinant (ADN recombiné) est une molécule d'ADN artificiel formée délibérément in vitro (par des méthodes de laboratoire de recombinaison génétique)...

• chromosome recombinant

  

  Un chromosome recombinant résulte d'inversions péricentriques parentales. Les chromosomes recombinants fournissent des délétions terminales et des duplications...

• clone

  

  Un clone est un organisme génétiquement identique (copie conforme exacte) obtenu par multiplication végétative (clonage) et issus d'un organisme parental...