Coloration de Gram

Définition

La méthode de coloration de Gram permet de faire la distinction entre les différents types de bactéries. Les caractéristiques de coloration de Gram des bactéries sont désignées comme positives ou négatives, selon que les bactéries absorbent et conservent la coloration au violet de cristal ou non.

Les colorations de Gram :

Une coloration de Gram au violet de cristal (à gauche), à l'iodine (centre-gauche), à l'alcool (centre-droite) et à la safranine (à droite).

La technique de coloration de Gram a été développée en 1884 par le bactériologiste danois Hans Christian Gram (1853–1938). Bien qu'une coloration de Gram n'indique pas l'espèce spécifique recherchée, elle peut être un moyen rapide de réduire considérablement la liste des candidats potentiels et de réaliser des tests de suivi si nécessaire. Le bactériologiste a mis au point une méthode de coloration des bactéries à l'aide d'un colorant appelé violet de cristal (gentiane).

Utilité importante de la coloration de Gram

Être capable de différencier les espèces bactériennes est important pour une foule de raisons, du diagnostic de l'infection ou de la vérification de la sécurité alimentaire à l'identification de l'espèce qui donne à un fromage son caractère fantastique. Les espèces bactériennes et même des souches spécifiques peuvent être différenciées à l'aide d'un certain nombre de techniques moléculaires telles que la PCR, la PCR quantitative, le séquençage du génome et la spectrométrie de masse.

Mais même sans entrer dans le vif du sujet moléculaire, il existe des différences phénotypiques entre les groupes de bactéries qui peuvent être utilisées pour les différencier. Cela inclut des caractéristiques telles que leur forme (bacilles vs cocci par exemple), la croissance de certains nutriments et la préférence pour les environnements riches ou faibles en oxygène.

En fonction de la caractéristique étudiée, les espèces bactériennes peuvent être décomposées en grands groupes,mais pris ensemble, ces informations peuvent réduire considérablement les identités possibles. Une telle classification utile - si une bactérie est Gram positif (bactérie Gram positif) ou Gram négatif (bactérie Gram négatif) - est basée sur la structure des parois cellulaires bactériennes.

Procédure de coloration de Gram

La préparation d'un échantillon pour une coloration de Gram suit cette procédure :

1. Étiquetez une lame de microscope en verre propre avec votre identification d'échantillon. Assurez-vous d'utiliser un crayon car de nombreuses encres sont éliminées par les réactifs utilisés dans la procédure de coloration.
2. Si vous préparez votre lame à partir d'une culture bactérienne liquide : tamponnez une petite goutte de culture sur la lame à l'aide d'une boucle stérile. Étalez doucement la gouttelette dans un mouvement circulaire dans une zone d'environ 1 cm de diamètre. Pour les cultures très denses, il peut être nécessaire de pré-diluer votre culture pour s'assurer que les cellules bactériennes individuelles peuvent être vues au microscope après la coloration.
   Si le matériel source provient d'une plaque bactérienne : remettre en suspension une boucle de matériel de colonie dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), puis procéder comme pour une culture liquide.
3. Une fois que le frottis a séché à l'air, passez la lame enduite à travers une flamme deux ou trois fois. Cela tue les microbes dans le frottis et fixe l'échantillon à la lame, faites attention à ne pas surchauffer l'échantillon cependant, car cela peut fausser la morphologie cellulaire.
4. Inonder doucement le frottis de cristal violet et laisser reposer 1 minute. Inclinez légèrement la lame et rincez doucement à l'eau du robinet ou à l'eau distillée. Le cristal violet est un colorant soluble dans l'eau qui pénètre dans la couche de peptidoglycane dans la paroi cellulaire bactérienne.
5. Inonder doucement le frottis avec de l'iode de Gram et laisser reposer 1 minute. Inclinez légèrement la lame et rincez doucement à l'eau du robinet ou à l'eau distillée. Le frottis apparaîtra maintenant violet. La solution d'iode de Gram (iode et iodure de potassium) est ajoutée pour former un complexe avec le cristal violet, qui est beaucoup plus gros et est insoluble dans l'eau.
6. Décolorez le frottis avec de l'alcool éthylique à 95 % ou de l'acétone. Inclinez légèrement la lame et appliquez l'alcool goutte à goutte jusqu'à ce que l'alcool soit presque transparent (5 à 10 secondes). Rincer immédiatement à l'eau pour éviter une décoloration excessive.
   Le décolorant déshydrate la couche de peptidoglycane, la rétrécit et la resserre. Chez les bactéries à Gram positif, les grands complexes cristal violet-iode sont alors incapables de pénétrer et de s'échapper de l'épaisse couche de peptidoglycane, ce qui donne des cellules colorées en violet. Cependant, chez les bactéries à Gram négatif, la membrane externe est dégradée, la fine couche de peptidoglycane est incapable de retenir les complexes cristal violet-iode et la couleur est perdue.
7. Noyer doucement avec un contre-colorant safranine et laisser reposer 45 secondes. Inclinez légèrement la lame et rincez doucement à l'eau du robinet ou à l'eau distillée. La safranine est faiblement soluble dans l'eau et colorera les cellules bactériennes d'un rouge clair, permettant la visualisation des cellules Gram négatives sans interférer avec l'observation du violet des cellules Gram positives.
8. Sécher la lame sur du papier filtre puis visualiser le frottis à l'aide d'un microscope optique sous immersion dans l'huile.

En rapport avec "coloration de Gram"

• colorant vital

  

  Un colorant vital est une substance, un colorant, qui colore des organismes ou des parties de ceux-ci sans entraîner leur mort.

• auxanogramme

  

  En biochimie et microbiologie, un auxanogramme est obtenu par auxanographie.

• bactérie à Gram négatif

  

  Une bactérie à Gram négatif est une bactérie avec des parois cellulaires épaisses.

• bactérie à Gram positif

  

  Une bactérie à Gram positif est une bactérie qui conserve la couleur violet de cristal lorsqu'elle est décolorée à l'alcool; elle se colore en violet foncé.