Polymorphisme de longueur des fragments

Définition

Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction, ou RFLP, est une méthode pour déterminer l'empreinte génétique par marqueurs moléculaires. Avec des fragments d'ADN coupés par des enzymes de restriction et avec une électrophorèse sur gel, deux échantillons d'ADN différents peuvent être comparés.

Procédure de polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) :

Procédure de polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP).

Explications

L'utilisation du polymorphisme de taille des fragments de restriction a été possible depuis que la découverte des endonucléases enzymatiques de restriction, une classe d'enzymes capables de reconnaître et de couper de courtes séquences de bases d'ADN (généralement 4 à 6 séquences de bases). Cette enzyme est produite par des bactéries et porte le nom de l'espèce de bactéries qui la produit.

Méthodes

En règle générale, l'ADN est d'abord extrait et purifié d'un échantillon individuel. L'ADN est ensuite sectionné en fragments de restriction au moyen d'endonucléases appelées enzymes de restriction, qui n'effectuent la coupure qu'en correspondance avec des séquences nucléotidiques particulières, spécifiques à chaque enzyme. Les fragments de restriction sont ensuite séparés en longueur par électrophorèse sur gel d'agarose.

Par la suite, grâce à la technique d'hybridation connue sous le nom de Southern-Blot, les bandes déterminées par hybridation sont identifiées avec des sondes de séquence connues radioactivement ou via des fluorochromes. Les différences entre les génotypes sont déterminées par le nombre de bandes qui apparaissent en utilisant la même sonde pour l'hybridation et qui est à son tour déterminée par le nombre de sites de coupe présents dans la séquence considérée.

Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction est codominant, assez abondant et la fréquence du polymorphisme est élevée. Ces marqueurs sont facilement cartographiés sur la carte génétique et sont stables (pas facile de changer les résultats une fois répétés).

Ce marqueur n'est pas non plus spécifique à l'espèce, car il n'est pas basé sur la PCR, de sorte que les résultats peuvent être utilisés pour comparer des cartes génétiques de différentes espèces. Faiblesses, ces marqueurs nécessitent de grandes quantités d'ADN, prennent beaucoup de temps (prend trois jours) et impliquent l'utilisation d'un marquage isotopique radioactif dans la technique qui a été utilisée pour la première fois.

Cette dernière faiblesse peut être surmontée après avoir découvert des techniques sans radioactivité.

Résultats

La distance entre les positions de coupe provoquée par les enzymes de restriction (les sites dits de restriction) est variable d'un individu à l'autre, entraînant ainsi des variations de longueur des fragments. Cela se reflète dans une position différente de certaines bandes sur le gel, d'où le terme polymorphisme.

Applications

L'analyse des variations du polymorphisme de taille des fragments de restriction dans les génomes a été un outil fondamental dans la cartographie du génome et l'analyse des maladies génétiques.

Initialement, les chercheurs ont basé leurs études sur la recherche de la position chromosomique du gène qui a déterminé une maladie particulière, avec cette technique, il est possible d'analyser l'ADN des membres d'une famille affectée par la maladie, de rechercher RFLP sur des allèles qui présentent un modèle similaire à celui héréditaire de la maladie.

Une fois que le gène responsable de la maladie a été localisé, l'analyse RFLP pourrait révéler qui était à risque pour la maladie, ou qui pourrait être un vecteur de gènes mutants.

L'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction a également été à la base des premières méthodes d'empreintes génétiques, utiles pour identifier les échantillons récupérés sur les scènes de crime, pour déterminer la paternité et pour caractériser la diversité génétique ou les modes de reproduction dans les populations animales.

Dans le cas des tests de paternité, la différence de RFLP peut être utilisée pour distinguer génétiquement deux individus ou pour montrer les relations génétiques entre les individus, car les enfants héritent du matériel génétique de leurs parents. Il est également utilisé pour déterminer les relations entre les différentes espèces.

Alternatives

La technique d'analyse RFLP est lente et lourde. Il nécessite une grande quantité d'ADN échantillon, et les processus de construction de la sonde, de fragmentation de l'ADN, d'électrophorèse, de transfert, d'hybridation, de lavage et d'autoradiographie peuvent prendre jusqu'à un mois.

Les résultats du projet sur le génome humain ont largement remplacé la nécessité de cartographier les RFLP et l'identification de nombreux polymorphismes mononucléotidiques (SNP) dans ce projet (qui permettent, par exemple, l'identification directe des gènes et des de nombreuses mutations) a remplacé la nécessité d'analyser les RFLP liés à la maladie.

Actuellement l'étude des différences de la séquence nucléotidique étudiée par RFLP est réalisée plus rapidement par réaction en chaîne par polymérase ou PCR. L'amplification peut être dirigée vers le site de restriction modifié et les produits digérés avec l'enzyme de restriction.