La centrifugation
La centrifugation est un processus dans lequel des substances de densités différentes dans un mélange hétérogène sont séparées par sédimentation à l'aide d'une centrifugeuse. Cependant, la centrifugation, bien qu'il s'agisse d'un processus de séparation, ne peut pas être considérée comme un processus de fractionnement à proprement parler car elle n'implique aucun changement de phase.
Un processus de centrifugation :
La centrifugation est une méthode de séparation de molécules de densités différentes en les faisant tourner en solution autour d'un axe (dans un rotor de centrifugeuse) à grande vitesse. Le processus de centrifugation repose sur la force perpendiculaire créée lorsqu'un échantillon tourne autour d'un point fixe. La vitesse de centrifugation dépend de la taille et de la densité des particules présentes dans la solution.
Généralités
La centrifugation est la technique de séparation des composants dans laquelle la force/accélération centrifuge entraîne le déplacement des molécules les plus denses vers la périphérie tandis que les particules les moins denses se déplacent vers le centre.
La centrifugation est utilisée dans les milieux industriels et de laboratoire, en particulier dans les industries chimiques et alimentaires et dans la recherche biologique. La centrifugation est également la méthode la plus couramment utilisée pour l'enrichissement de l'uranium, reposant sur la légère différence de masse entre les atomes d'U238 et d'U235 dans l'hexafluorure d'uranium gazeux. Dans le fractionnement isotopique, la force centrifuge agit plus fortement sur les molécules lourdes que sur les molécules légères, augmentant la concentration des isotopes lourds dans la région externe.
Dans une solution, les particules dont la densité est supérieure à celle du solvant coulent (sédiments) et les particules plus légères flottent vers le haut. Plus la différence de densité est grande, plus ils se déplacent rapidement. S'il n'y a pas de différence de densité (conditions isopycniques), les particules restent stables. Pour tirer parti des différences de densité même infimes pour séparer diverses particules dans une solution, la gravité peut être remplacée par la "force centrifuge" beaucoup plus puissante fournie par une centrifugeuse.
Une centrifugeuse est un équipement qui met un objet en rotation autour d'un axe fixe (le fait tourner en cercle), en appliquant une force potentiellement forte perpendiculaire à l'axe de rotation (vers l'extérieur). La centrifugeuse fonctionne selon le principe de sédimentation, où l'accélération centripète provoque le déplacement de substances et de particules plus denses vers l'extérieur dans la direction radiale.
Dans le même temps, les objets moins denses sont déplacés et se déplacent vers le centre. Dans une centrifugeuse de laboratoire qui utilise des tubes d'échantillons, l'accélération radiale fait que les particules plus denses se déposent au fond du tube, tandis que les substances de faible densité montent vers le haut.
Centrifugation analytique
La centrifugation analytique est une méthode de séparation dans laquelle les particules d'un échantillon sont séparées en fonction de leur densité et de la force centrifuge qu'elles subissent. L'ultracentrifugation analytique (AUC) est une méthode polyvalente et robuste pour l'analyse quantitative des macromolécules en solution.
Principe de centrifugation analytique :
- La centrifugation analytique est basée sur le principe que les particules plus denses que les autres se déposent plus rapidement. De même, les plus grosses molécules se déplacent plus rapidement dans la force centrifuge que les plus petites.
- L'ultracentrifugation analytique pour la détermination de la masse moléculaire relative d'une macromolécule peut être réalisée par une approche de vitesse de sédimentation ou une méthodologie d'équilibre de sédimentation.
- Les propriétés hydrodynamiques des macromolécules sont décrites par leurs coefficients de sédimentation. Ils peuvent être déterminés à partir de la vitesse à laquelle une limite de concentration des biomolécules particulières se déplace dans le champ gravitationnel.
- Le coefficient de sédimentation peut être utilisé pour caractériser les changements de taille et de forme des macromolécules avec des conditions expérimentales changeantes.
- Trois systèmes optiques sont disponibles pour l'ultracentrifugeuse analytique (absorbance, interférence et fluorescence) qui permettent une observation précise et sélective de la sédimentation en temps réel.
Étapes de centrifugation analytique :
- Des échantillons de petite taille (20–120 mm 3) sont prélevés dans des cellules analytiques pour être placés à l'intérieur de l'ultracentrifugeuse.
- L'ultracentrifugeuse est ensuite actionnée de sorte que la force centrifuge provoque une migration des biomolécules réparties de manière aléatoire à travers le solvant radialement vers l'extérieur à partir du centre de rotation.
- La distance des molécules au centre est déterminée par le système optique Schlieren.
- Un graphique est tracé à partir de la concentration de soluté par rapport à la distance radiale au carré du centre de rotation, sur la base de laquelle la masse moléculaire est déterminée.
Utilisations de la centrifugation analytique :
- La centrifugation analytique peut être utilisée pour la détermination de la pureté des macromolécules.
- Elle peut également être utilisée pour l'examen des modifications de la masse moléculaire des complexes supramoléculaires.
- De plus, elle permet la détermination de la masse moléculaire relative des solutés à l'état natif.
Centrifugation en gradient de densité
La centrifugation à gradient de densité est la séparation de molécules où la séparation est basée sur la densité des molécules lorsqu'elles traversent un gradient de densité sous une force centrifuge.
Principe de la centrifugation par gradient de densité :
- La centrifugation à gradient de densité est basée sur le principe que les molécules se déposent sous une force centrifuge jusqu'à ce qu'elles atteignent un milieu de densité identique à la leur.
- Dans ce cas, un milieu avec un gradient de densité est utilisé, qui doit soit diminuer la densité, soit augmenter la densité.
- Les molécules d'un échantillon se déplacent dans le milieu lorsque l'échantillon est mis en rotation, créant une force centrifuge.
- Les molécules les plus denses commencent à se déplacer vers le bas à mesure qu'elles traversent le gradient de densité.
- Les molécules deviennent alors suspendues à un point où la densité des particules est égale au milieu environnant.
- De cette manière, des molécules de densités différentes sont séparées au niveau de différentes couches qui peuvent ensuite être récupérées par différents procédés.
Étapes de la centrifugation en gradient de densité :
- Un gradient de densité d'un milieu est créé en déposant doucement la concentration inférieure sur les concentrations supérieures dans un tube à centrifuger.
- L'échantillon est ensuite placé sur le gradient, et les tubes sont placés dans une ultracentrifugeuse.
- Les particules traversent le gradient jusqu'à ce qu'elles atteignent un point où leur densité correspond à la densité du milieu environnant.
- Les fractions sont retirées et séparées, obtenant les particules sous forme d'unités isolées.
Utilisations de la centrifugation à gradient de densité :
- La centrifugation à gradient de densité peut être appliquée pour la purification de grands volumes de biomolécules.
- Elle peut même être utilisé pour la purification de différents virus, ce qui facilite leurs études ultérieures.
- Cette technique peut être utilisée à la fois comme technique de séparation et comme technique de détermination des densités de diverses particules.
Exemples de centrifugation à gradient de densité :
- Cette méthode a été utilisée dans la célèbre expérience, qui a prouvé que l'ADN est semi-conservateur en utilisant différents isotopes de l'azote.
- Un autre exemple est l'utilisation de cette technique pour l'isolement de la fraction microsomale à partir d'homogénats musculaires et la séparation ultérieure des vésicules membranaires avec une densité différente.
Centrifugation différentielle
La centrifugation différentielle est un type de processus de centrifugation dans lequel les composants sont déposés séparément dans un tube de centrifugation en appliquant une série de forces centrifuges croissantes.
Principe de centrifugation différentielle :
- La centrifugation différentielle est basée sur les différences de vitesse de sédimentation de particules biologiques de différentes tailles et densités.
- Au fur et à mesure que la force centrifuge croissante est appliquée, une sédimentation initiale des molécules plus grosses a lieu.
- D'autres particules se déposent en fonction de la vitesse et de la durée des étapes de centrifugation individuelles et de la densité et de la taille relative des particules.
- La plus grande classe de particules forme une pastille au fond du tube de centrifugation, laissant des structures de plus petite taille dans le surnageant.
- Ainsi, les molécules plus grosses sédimentent rapidement et à des forces centrifuges plus faibles, tandis que les molécules plus petites prennent plus de temps et des forces plus élevées.
- Dans le cas de particules moins denses que le milieu, les particules flotteront au lieu de se déposer.
Étapes de la centrifugation différentielle :
- La solution échantillon est homogénéisée dans le milieu contenant le tampon.
- L'échantillon est ensuite placé dans le tube de centrifugation, qui est actionné à une force centrifuge particulière pendant un temps spécifique à une température particulière.
- A la fin de cette opération, un culot se formera au fond du tube, qui sera séparé du surnageant.
- Le surnageant est ajouté à un nouveau tube de centrifugation où il est centrifugé à une autre vitesse pendant un temps et une température particuliers.
- À nouveau, le surnageant est séparé des culots formés.
- Ces étapes se poursuivent jusqu'à ce que toutes les particules soient séparées les unes des autres.
- Les particules peuvent ensuite être identifiées en testant des indicateurs qui sont uniques aux particules spécifiques.
Utilisations de la centrifugation différentielle :
- La centrifugation différentielle est couramment utilisée pour la séparation des organites cellulaires et des membranes présentes dans la cellule.
- Il peut également être utilisé pour la séparation à basse résolution du noyau.
- Comme cette technique sépare les particules en fonction de leur taille, elle peut être utilisée pour la purification d'extraits contenant des impuretés de plus grande taille.
Centrifugation isopycnique
La centrifugation isopycnique est un type de centrifugation dans lequel les particules d'un échantillon sont séparées en fonction de leur densité lorsque la force centrifuge est appliquée à l'échantillon.
Principe de la centrifugation isopycnique :
- La centrifugation isopycnique est également appelée centrifugation à l'équilibre car la séparation des particules se fait uniquement sur la base de leurs densités et non sur leurs tailles.
- Les particules se déplacent vers le bas et le mouvement est basé sur la taille des particules. Et, le flux cesse une fois que la densité de la particule devient égale à la densité du milieu environnant.
- La densité du gradient augmente à mesure que nous descendons le tube vers le bas. En conséquence, les particules avec des densités plus élevées se déposent au fond, suivies de particules moins denses qui forment des bandes au-dessus des particules plus denses.
- Il est considéré comme un véritable équilibre car celui-ci dépend directement des densités de flottaison et non de la taille des particules.
Étapes de la centrifugation isopycnique :
- Un gradient préparé avec une densité croissante vers le bas du tube est préparé. Un dégradé pré-réalisé peut également être utilisé.
- La solution de l'échantillon biologique et du sel est uniformément répartie dans le tube de centrifugation et placée à l'intérieur de la centrifugeuse.
- Une fois la centrifugeuse en marche, un gradient de densité du sel se forme dans le tube.
- Les particules se déplacent dans le tube et se déposent lorsqu'elles atteignent la région avec leurs densités respectives.
- Les particules sont ensuite séparées et identifiées à l'aide de différents autres procédés.
Utilisations de la centrifugation isopycnique :
- La centrifugation isopycnique peut être appliquée pour la purification de grands volumes de biomolécules.
- Cette technique peut être utilisée comme technique de détermination des densités de diverses particules.
Centrifugation par gradient de densité zonale/centrifugation en zone mobile
La centrifugation à gradient de densité zonale est un type de centrifugation qui sépare les particules sur la base de leur forme en tant que taille et fonctionne sur le même principe de centrifugation à gradient de densité mais fonctionne d'une manière différente. On l'appelle aussi centrifugation à zone mobile.
Principe de la centrifugation par gradient de densité zonale :
- La centrifugation zonale fractionne les particules en fonction de leur taille et de leur forme.
- La procédure consiste à superposer un échantillon dans une zone restreinte au-dessus d'un gradient de densité pré-coulé. Le gradient de densité est ensuite centrifugé.
- Toutes les particules migrent dans le gradient de densité car le gradient de densité n'a que des densités bien inférieures aux densités des particules centrifugées.
- Les particules sont fractionnées principalement par taille et forme. Plus une particule est grosse, plus elle sédimente rapidement.
- Plus une particule est à symétrie sphérique, plus elle sédimente rapidement.
- Les particules sédimentent à travers le gradient à une vitesse qui est fonction de leur coefficient de sédimentation.
- Contrairement à la centrifugation différentielle où l'échantillon est réparti dans tout le milieu, dans la centrifugation zonale, l'échantillon est initialement présent uniquement au-dessus du gradient sous forme de bande étroite.
Étapes de la centrifugation par gradient de densité zonale :
- Un gradient de densité est préparé dans un tube à centrifuger avant d'appliquer l'échantillon.
- Le même est ensuite superposé sur le dessus du dégradé sous la forme d'une bande.
- Pendant la centrifugation, les particules en mouvement rapide (de plus grande taille et de forme circulaire) se déplacent devant les particules plus lentes de sorte que différentes particules sont séparées en différentes bandes sur différentes parties du gradient.
- Les particules sont séparées sur la base de leurs coefficients de sédimentation, et elles sont extraites du fond du tube à travers une perforation.
Utilisations de la centrifugation par gradient de densité zonale :
- La centrifugation différentielle à taux zonal a été utilisée pour la séparation des virus car ils ont des composants de taille et de densité différentes qui sont uniques à chaque virus.
- Cette méthode a été employée pour le fractionnement de l'ARN sur des gradients de saccharose.
- En outre, la centrifugation différentielle à taux zonal a également été utilisée pour la séparation, la purification et le fractionnement des molécules d'ADN des virus et des bactéries.
- Le fractionnement des polysomes et des sous-unités de ribosomes a été l'une des premières applications de cette méthode.
Centrifugation à vitesse différentielle (limite mobile)
La centrifugation à vitesse différentielle est un type de processus de centrifugation dans lequel les composants sont déposés séparément dans un tube de centrifugation en appliquant une série de vitesses croissantes.
Principe de centrifugation à vitesse différentielle (limite mobile) :
- La centrifugation différentielle est basée sur les différences de vitesse de sédimentation de particules biologiques de différentes tailles et densités.
- Au fur et à mesure que la vitesse croissante des rotors est appliquée, une sédimentation initiale des molécules plus grosses a lieu.
- D'autres particules se déposent en fonction de la vitesse et de la durée des étapes de centrifugation individuelles et de la densité et de la taille relative des particules.
- La plus grande classe de particules forme une pastille au fond du tube de centrifugation, laissant des structures de plus petite taille dans le surnageant.
- Le culot est ensuite retiré et le surnageant est encore centrifugé pour obtenir des particules plus petites.
- Ainsi, les molécules plus grosses sédimentent rapidement et à des vitesses plus faibles, tandis que les molécules plus petites prennent plus de temps et des vitesses plus élevées.
- Dans le cas de particules moins denses que le milieu, les particules flotteront au lieu de se déposer.
Étapes de centrifugation à vitesse différentielle :
- La solution échantillon est homogénéisée dans le milieu contenant le tampon.
- L'échantillon est ensuite placé dans le tube de centrifugation, qui fonctionne à une vitesse de rotor inférieure pendant un temps particulier à une température particulière.
- A la fin de cette opération, un culot se formera au fond du tube, qui sera séparé du surnageant.
- Le surnageant est ajouté à un nouveau tube de centrifugation où il est centrifugé à une autre vitesse pendant un temps et une température particuliers.
- A nouveau, le surnageant est séparé des culots formés.
- Ces étapes se poursuivent jusqu'à ce que toutes les particules soient séparées les unes des autres.
- Les particules peuvent ensuite être identifiées en testant des indicateurs qui sont uniques aux particules spécifiques.
Utilisations de la centrifugation à vitesse différentielle :
- La centrifugation différentielle est couramment utilisée pour la séparation des organites cellulaires et des membranes présentes dans la cellule.
- Elle peut également être utilisée pour la séparation à basse résolution du noyau.
- Comme cette technique sépare les particules en fonction de leur taille, elle peut être utilisée pour l'identification et la comparaison de particules de différentes tailles.
Centrifugation en gradient de densité d'équilibre
La centrifugation à gradient de densité à l'équilibre est une forme modifiée et spécialisée de centrifugation à gradient de densité.
Principe de la centrifugation en gradient de densité d'équilibre :
- La centrifugation à gradient de densité d'équilibre est basée sur le principe que les particules dans une solution sont séparées sur la base de leurs densités.
- Dans ce cas, les particules se déplacent à travers le gradient de densité et s'arrêtent dans une région où la densité du milieu est égale à la densité de la particule.
- À ce stade, la force centrifuge agissant sur la particule est égale à la force de flottabilité poussant les particules vers le haut. En conséquence, les particules cessent de bouger et peuvent être séparées en différentes couches.
- La densité du gradient augmente à mesure que nous descendons le tube vers le bas. En conséquence, les particules avec des densités plus élevées se déposent au fond, suivies de particules moins denses qui forment des bandes au-dessus des particules plus denses.
Étapes de la centrifugation en gradient de densité d'équilibre :
- Un gradient préparé avec une densité croissante vers le bas du tube est préparé. Un dégradé pré-réalisé peut également être utilisé.
- La solution de l'échantillon biologique et du sel est uniformément répartie dans le tube de centrifugation et placée à l'intérieur de la centrifugeuse.
- Une fois la centrifugeuse en marche, un gradient de densité du sel se forme dans le tube.
- Les particules se déplacent dans le tube et se déposent lorsqu'elles atteignent la région avec leurs densités respectives.
- Les particules sont ensuite séparées et identifiées à l'aide de différents autres procédés.
Utilisations de la centrifugation par gradient de densité d'équilibre :
- La centrifugation à gradient de densité d'équilibre peut être appliquée pour la purification de grands volumes de biomolécules.
- Cette technique peut être utilisée comme technique de détermination des densités de diverses particules.
Exemples de centrifugation à gradient de densité d'équilibre :
- Cela a été utilisé dans des expériences réalisées par Meelson et Stahl pour déterminer les densités de différentes molécules d'ADN en fonction de l'endroit où elles ont atteint le gradient de densité.
Centrifugation en gradient de saccharose
La centrifugation en gradient de saccharose est un type de centrifugation en gradient de densité où le gradient de densité est formé de saccharose en modifiant la concentration de saccharose.
Principe de la centrifugation en gradient de saccharose :
- La centrifugation en gradient de saccharose est basée sur le principe que les molécules se déposent sous l'effet d'une force centrifuge jusqu'à ce qu'elles atteignent un milieu de densité identique à la leur.
- Dans ce cas, un milieu avec un gradient de saccharose est utilisé, qui a soit une densité plus faible en haut et une densité plus élevée en bas.
- Les molécules d'un échantillon se déplacent dans le milieu lorsque l'échantillon est mis en rotation, créant une force centrifuge.
- Les molécules les plus denses commencent à se déplacer vers le bas à mesure qu'elles traversent le gradient de densité.
- Les molécules deviennent alors suspendues à un point où la densité des particules est égale au milieu environnant.
- De cette manière, des molécules de densités différentes sont séparées au niveau de différentes couches qui peuvent ensuite être récupérées par différents procédés.
Étapes de la centrifugation en gradient de saccharose :
- Un gradient de densité de saccharose est créé en déposant doucement la concentration inférieure de saccharose sur les concentrations supérieures dans un tube à centrifuger.
- L'échantillon est ensuite placé sur le gradient, et les tubes sont placés dans une ultracentrifugeuse.
- Les particules traversent le gradient jusqu'à ce qu'elles atteignent un point où leur densité correspond à la densité du milieu environnant.
- Les fractions sont retirées et séparées, obtenant les particules sous forme d'unités séparées.
Utilisations de la centrifugation en gradient de saccharose :
- La centrifugation en gradient de saccharose est une technique puissante pour la séparation de macromolécules telles que l'ADN et l'ARN.
- Cela a également été utilisé pour l'analyse de complexes protéiques et pour déterminer la densité ainsi que la taille de diverses autres macromolécules.
En rapport avec "centrifugation"
Est centrifuge ce qui tend à (s')éloigner du centre, d'un axe (axifuge). On évoque souvent la force centrifuge en l'opposant à la force centripète.
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