Pyroséquençage

Définition

Le pyroséquençage est une technologie de séquençage de l'ADN sans gel et par synthèse, qui consiste à obtenir des informations génétiques en synthétisant le brin d'ADN allongé en utilisant le brin complémentaire comme matrice.

Le pyroséquençage est une méthode de séquençage basée sur la réplication dans laquelle l'ajout du nucléotide correct à l'ADN matrice immobilisé est signalé par une réaction photométriquement détectable.

Exemple de pyroséquençage :

Processus de préparation d'une bibliothèque d'ADN par pyroséquençage. (A) Fragmentation et dénaturation de l'ADN séquencé ainsi que des adaptateurs supplémentaires et de la biotine. fixation individuelle de l'ADNsb sur des billes recouvertes de streptavidine. (B) emPCR et chargement des réactifs sur la plaque de réaction pour le pyroséquençage.

Explications

En 1993, l'un des premiers séquenceurs d'ADN de deuxième génération est apparu, lorsque le Dr Bertil Pettersson, le Dr Mathias Uhlen et Pal Nyren ont introduit le pyroséquençage, souvent décrit comme le pionnier du séquençage de l'ADN de nouvelle génération.

Le pyroséquençage est une alternative intéressante au séquençage conventionnel au bisulfite. Le séquençage au bisulfite est la méthode de traitement des échantillons d'ADN avec du bisulfite de sodium pour déterminer son modèle de méthylation.

Le pyroséquençage détecte la luminescence issue de la libération de pyrophosphate lors de l'incorporation du nucléotide dans le brin complémentaire. Les études de pyroséquençage nécessitent également de coupler le traitement au bisulfite de l'ADN génomique avec l'amplification par PCR de la séquence cible, mais l'avantage du pyroséquençage est que des données quantitatives sur la méthylation de l'ADN peuvent être obtenues à partir du séquençage direct des produits de PCR sans nécessiter de clonage dans des vecteurs d'expression bactériens et de séquençage d'un un grand nombre de clones.

D'autre part, la qualité des données diminue avec la distance entre le CpG et l'extrémité 3′ de l'amorce directe, ce qui limite le nombre de bases pouvant être analysées dans une seule réaction de séquençage.

Préparation d'une bibliothèque d'ADN par pyroséquençage

Le séquençage commence par la fragmentation et la dénaturation de l'ADN séquencé pour former des fragments d'ADN simple brin (ADNsb) d'une longueur de 300 à 500 nucléotides, où des séquences adaptatrices sont ajoutées aux deux extrémités.

Ensuite, la bibliothèque d'ADN résultante est attachée de manière covalente à des billes microscopiques via la séquence adaptatrice qui subit une réaction en chaîne par polymérase en émulsion (emPCR) pour former des millions de copies identiques d'ADNsb liées de manière covalente à des billes microscopiques.

Ces billes microscopiques sont ajoutées à une plaque de réaction, où il n'y a qu'une seule bille dans chaque puits. Chacun de ces puits contient de l'ADN polymérase (DNAP), de l'adénosine phosphosulfate (APS), de l'ATP sulfurylase, de la luciférine et de la luciférase.

Pour initier la synthèse de l'ADN, une amorce complémentaire à la séquence adaptatrice est ajoutée aux puits, ce qui permet à l'ADNP de se lier et de synthétiser le brin allongé suite à l'ajout de l'un des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP). Il est important de noter que plutôt que d'utiliser le désoxyadénosine triphosphate (dATP), le désoxyadénosine alpha-thio triphosphate (dATP ?S) est utilisé à la place, car il peut être utilisé efficacement par l'ADNP pour être incorporé dans le brin d'ADN en cours d'allongement sans être reconnu par la luciférase. Le dATP peut être reconnu par la luciférase, ce qui entraînerait une production indésirable de lumière.

Chaque fois qu'un nucléotide est incorporé avec succès dans le brin d'ADN en cours d'allongement, un pyrophosphate (PPi) est libéré, qui réagit avec l'APS dans la solution, entraînant la formation d'ATP, qui est catalysée par l'ATP sulfurylase. Ensuite, l'ATP entraîne la conversion de la luciférine en oxyluciférine et en lumière, qui est catalysée par la luciférase. La lumière générée est capturée par le capteur du dispositif à couple chargé situé sous les puits. La quantité de lumière produite est directement proportionnelle à la quantité d'ATP dans la solution ce qui fournit des informations sur le nombre de dNTP ajoutés consécutivement au brin d'ADN en cours d'allongement. Cependant, c'est l'un des inconvénients du pyroséquençage car il est difficile d'identifier et d'interpréter avec précision les séquences d'homopolymères, qui sont essentiellement de nombreux nucléotides répétés, car le signal devient moins clair. Le processus d'ajout de l'un des quatre désoxynucléotides triphosphates (dNTP) jusqu'à ce que l'ADNP l'incorpore dans le brin d'ADN en cours d'allongement est indiqué par la détection de la lumière et est répété jusqu'à ce qu'il atteigne la fin du fragment d'ADN. Une fois l'élongation terminée, les données sont analysées par des programmes informatiques, permettant aux scientifiques de séquencer avec succès la molécule d'ADN originale.

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